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深圳先进院 | 新的肽类激素MTL显示改善脂肪肝潜力

时间:2020-06-05   访问量:438


 快  讯


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中国科学院深圳先进技术研究院任培根博士研究组与张键博士研究组合作在非酒精性脂肪肝(NAFLD)的干预研究方面取得进展。相关论文于305日在国际肝病研究期刊Journal of Hepatology 上发表。该研究的核心是发现了一种新型肽Metabolitin (MTL),能系统地抑制肠道脂肪酸的吸收,改善胰岛素抵抗(IR),具有治疗NAFLD的潜力。

 

肽研社有幸获得任博士的授权,对其研究进行报导。若有业界对该项目有投资或合作意向,肽研社亦可为您引荐。接下来我们走进看看任博士的这项研究——



亮 点


新的小鼠肽类激素——MTL调节小鼠的脂肪和糖代谢,改善NAFLD和IR。


MTL治疗NAFLD的主要机制是抑制肠道脂肪吸收。


MTL通过与其受体GPRC6A的结合和相互作用实现其生物学功能。



  主旨


这项研究以生物信息学、生物学功能研究及质谱鉴定技术为基础,在小鼠中鉴定出了一个十五肽MTL,它来源于骨钙素(OCN),由转化酶裂解位点翻译后加工形成。研究团队采用配体-受体结合、受体内化、BRETNaono ITC等方法证实了MTLG蛋白耦联受体C家族6AGPRC6A)的结合关系。同时,BRET验证了MTLGPRC6A的结合具有极性特征,其N端为受体结合区域。


为进行体内生物学研究,对高脂饮食(HFD)诱导的Obesity-NAFLD-T2DM野生型小鼠模型进行注射或灌胃MTL,研究MTLNAFLD的作用。从功能研究来看,腹腔内(i.p.)注射或口服MTL可有效改善小鼠NAFLD和胰岛素抵抗(IR)。与肠道表达的GPRC6A相互作用,灌胃或腹腔内注射MTL可显著抑制肠神经降压素(NT)的分泌,进而通过AMPK通路抑制甘油三酯(TG)的吸收,但对胆固醇肠吸收无明显影响。此外,MTL还可诱导GLP-1分泌。由于MTL固有的结构,肠内吸收的MTL表现出与腹腔注射MTL相似的生物学效应和效力。这些明显改善的NAFLD症状表明:在Obesity-NAFLD-T2DM小鼠模型中,这种新的小鼠肽激素MTL可能成为治疗NAFLD的潜在候选物分子。



解读


肥胖、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和2型糖尿病(T2DM)形成的原因是能量摄入过多和其他致肥胖因素。肥胖会增加NAFLDT2DM,心血管疾病和某些癌症的风险。肠道吸收大量脂肪酸可导致肥胖,并在肝脏,骨骼肌和脂肪组织中积累,导致胰岛素抵抗(IR),并有助于T2DM的发展。同时,高胰岛素血症或高血糖症会加速NAFLD的恶化,从而形成“恶性循环”。肠道吸收可能在疾病进展中起关键作用,代谢紊乱恶化的潜在机制仍然未知,仍缺乏特异性药物。


骨钙素(OCN)是骨基质蛋白和骨形成的生物标志物,主要来自成骨细胞。未羧化的OCNucOCN)被认为能够调节小鼠体内葡萄糖代谢,能量消耗,增加β细胞增殖,胰岛素表达和分泌以及改善胰岛素敏感性。最近的一些研究强调了与肝功能酶和炎性标志物负相关的血清OCN降低并调查了OCN对小鼠模型中NAFLD发育和进展的影响。

1.      发现MTL

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图1.MTLNAFLD中的作用机制图

 

寻找:为了寻找可能源于prepro-OCN的预测肽激素,研究者在GenBank中搜索了人类OCN基因的直系同源物,比较了来自哺乳动物和其他脊椎动物的OCN序列,在其中研究者鉴定了两个保守的区域,它们位于潜在的转化酶切割位点旁。在小鼠中,编码15个氨基酸的肽的区域被称为MTL,它具有保守的多脯氨酸残基和OCN3Gla位点中的一个;位于C末端的另一个保守区域被称为OC22。根据体外研究,发现MTL在小鼠血清中具有抗消化的特性。研究者通过GALAXY蛋白质建模程序,预测了MTL的二级结构,认为MTL的抗消化性可能是由于保守的多脯氨酸形成的卷曲状二级结构所致。

 

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图2.MTLGPRC6A的对接位点(A)与MTL结构(B)的计算预测

 

检测:为了检测小鼠血清中的内源性MTL,研究者自制MTL单克隆抗体(MmAb)以浓缩血清中的MTL。通过Western blotELISA法,MmAb识别MTL的能力得到确认。浓缩后小鼠血清的质谱分析显示,一个分子量为771.88的峰与MTL完全匹配,并鉴定了该峰氨基酸序列为YLGASVPSPDPLEPT,与MTL完全一致。

 

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图3.Western blot12和竞争ELISA法检测MTL单克隆抗体的特异性

 

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图4.通过LC MS / MSMTL鉴定为小鼠中的内源激素

 

定量:为了准确定量循环中的MTL,根据不同浓度母离子峰的峰面积,制备了用于质谱测量的MTL标准曲线,得到的结果为:瘦小鼠和肥胖小鼠的平均血清MTL浓度分别为454.71±28.76 ng / ml143.92±2.62 ng / ml


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图5.正常和肥胖-T2DM小鼠的血清MTL水平

 

2.      研究GPRC6AMTL / OCN之间的关系

虽然之前没有OCNGPRC6A的直接配体-受体相互作用的证据,但GPRC6A被广泛认为是OCN的内源性受体。该课题组用不同的生化和生物物理分析方法研究了GPRC6AMTL / OCN之间的关系,包括cAMP刺激,受体内在化,配体-受体结合,BRETNano ITC


GPRC6A-HEK293稳定细胞系中,cAMPMTL刺激,这表明MTL可以像OCN一样通过GPRC6A激活Gs通路,而OC22则没有。在信号转导过程之后,活化的GPCR从质膜转移到内涵体室膜,观察到了MTLOCN,但未观察到OC22诱导的GPRC6A内在化。荧光配体-受体结合实验表明,MTL以高亲和力结合GPRC6AMTLOCNIC50分别为20 nmol / L13.6 nmol / L。而GPRC6A转染的细胞无法吸收OC22。此外,结果证明,人MTL可以与小鼠MTL竞争性地与小鼠GPRC6A的位点结合。为了弥补荧光配体-受体结合实验的低灵敏度,以及进一步确认相互作用,研究团队设计了BRETNano ITC来确认相互作用。BRET结果表明MTLOCN与其受体均在分子结合距离内。更重要的是,研究证明了MTL只能通过其N端与GPRC6A结合,而不能通过C端结合,即具有极性特性。从Nano ITC测试获得的功率vs.时间的滴定曲线表明,在滴定系统中,位于细胞膜分离物中的MTLGPRC6A之间存在反应。


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图6.MTL刺激表达GPRC6AHeLaHEK293T细胞系中的cAMP产生和MTL-GPRC6A相互作用

 

3.      MTL的生物功能

研究中使用了高脂饮食(HFD)诱发的Obesity-NAFLD-T2DM小鼠模型。与对照组HFD组相比,接受MTL治疗的肥胖小鼠在治疗2周后血糖水平较低,在6周后血清胰岛素水平较高。通过RT-qPCRELISA方法,研究者发现MTLOCN刺激后,血清中胰高血糖素样肽-1GLP-1)的基因和蛋白质表达增加。肠降血糖素GLP-1由小肠中的肠内分泌L细胞产生,并通过与β细胞或外周组织中的受体结合来达到其促胰岛素作用并改善胰岛素/敏感性。经MTL处理的小鼠血清胰岛素和GLP-1水平升高与胰腺胰岛面积增加相对应。GTTITT结果进一步表明,胰岛素抵抗和不敏感性得到了纠正。


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图7.MTL可改善小鼠模型中的葡萄糖代谢和胰岛素敏感性。建立动物模型后,每天交替使用单侧腹膜内注射开始用MTLOCN(均在0.9NaCl + 0.1BSA中)治疗小鼠。注射(剂量为2 pmol / g6 pmol / g20 pmol / g10 µl /克体重)

 

HFD诱导的Obesity-NAFLD-T2DM小鼠患有严重的肝脂肪变性。使用MTL后,HFD小鼠的肝脏脂肪变性显示出与正常饮食对照组相似的外观。肝染色试验显示,经治疗的小鼠肝细胞脂质积累少得多。包括ALTASTALPLDLTGTC在内的血液生化分析表明,肝功能和脂质代谢也得到了显著改善。此外,MTL治疗后肝脏中的脂质合成受到影响:肝细胞AMPK通路可以被MTL刺激,然后抑制其下游酶乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的活化。激活的AMPK通路还抑制了另一种下游脂肪生成转录因子SREBP。另外,通过shRNA进行了GPRC6A的基因敲低,磷酸化的AMPKACC明显降低。


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图8.MTL改善小鼠模型的脂肪性肝炎和肥胖症

 

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图9.AMPKACC磷酸化的GPRC6A肝细胞中MTL的作用受到抑制

 

4.      口服MTL生物活性研究

基于MTL的内在序列和结构预测以及OCN的先前研究,研究了口服MTL的生物活性。MTL在血清和胃肠道(GI)中不常见的抗消化特性可能是由于保守的多脯氨酸形成了螺旋状二级结构。在灌胃MTL 7周后,体重,血糖水平,葡萄糖耐量和胰岛素分泌等的结果与腹腔注射动物相似。除了肝脂肪变性的组织学观察,研究者还采用了非侵入性的体内MRI成像方法来评估肝脏MTL的作用。MRI扫描得到的立体图像表明肝脏中的脂肪变性组织减少一半。在HFD喂养组中,经MTL治疗后体重呈下降趋势,外周脂肪组织附睾脂肪垫明显缩小,脂肪细胞体积显著减少。


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图10.实验结果

 

5.      研究MTL在肠道中的作用

MTL在肠胃方面的功能引起研究团队的兴趣。GPRC6A在人肠中的表达尚不确定,但已知其在小鼠小肠中的表达。小鼠血清和粪便中的TGTC水平表明MTL和肠道脂肪吸收有关。与对照组相比,MTL治疗组的粪便TG含量增加了约30%,而TC没有。为了证明小肠和MTL如何参与TG的排泄过程,进行了急性脂质吸收实验。与对照小鼠相比,在经MTL处理的小鼠的空肠近端的绒毛肠中,发现的脂质液滴少得多。同时,长期治疗的小鼠在血清和小肠中NT的基因和蛋白质表达显著降低,而在小肠中也降低,但由于治疗时间短,在急性治疗小鼠的血清中却没有。已知NT位于小鼠,大鼠和人的小肠中,并且可以通过脂肪摄取来刺激以促进脂肪酸移位。如先前报道,发现肠细胞AMPK表达被NT表达的抑制所刺激。口服或腹膜内注射MTL可通过抑制脂质吸收和胰岛素抵抗来显著改善NAFLD症状。MTL可能是治疗NAFLD的潜在治疗候选物。



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图11.灌胃后MTL通过NT-AMPK途径抑制小肠脂肪吸收


6.      前景

这项研究发现MTL可以调节NTGLP-1参与脂肪和糖代谢,首次证明了MTLOCN可以调节肠道NT的表达,控制脂肪的吸收。当前的研究显示了MTL治疗NAFLD的潜力。虽然尚未进行人MTL的研究,但鼠MTL对血糖和胰岛素分泌的温和控制,无脂肪泻发生以及其生物安全性,为MTL未来的发展提供了更多的可能性。



关于任培根博士


任培根博士,系中国科学院深圳先进技术研究院研究员,中国科学院大学博士生导师,印度VIT大学兼职教授,深圳市儿童医院、深圳罗兹曼国际转化医学研究院与中科院深圳先进院共同博士后导师。


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图12.任培根博士

获得中国科学院北京微生物所博士学位后(日本理化学研究所共同培养),2004年,任博士前往美国斯坦福大学医学院从事博士后研究,2009年起任研究科学家。2010年底被引进加入中国科学院深圳先进技术研究院。2011年获深圳市首批海外高层次人才。


任博士回国后共获得并主持包括科技部973项目、广东省项目、深圳市海外高层次人才团队项目、基础重点、基础研究布局等多个项目。多年来为以下项目担任评审专家,包括:中国博士后基金、中国科学院国际人才计划(PIFI)外国青年学者项目、山东省科技厅科学技术奖、江西省科技厅项目等。


任博士为美国内分泌协会会员,美国骨研究协会会员,中国微生物研究协会终身会员和ICHTS会员。已在包括ScienceJ HeptaBiomaterialsActa Biomaterialias等在内的多个国际著名期刊上发表研究论文60余篇,H因子=19,他引2100余次;参与出版学术著作4部;多次在ENDOORSTermis等国际会议上汇报研究成果;担任InflammationBasic Res. Cardiol., Tissue Engineering, JBMR-A, Gene Therapy, e Cells Materials J30多种期刊专业审稿人。拥有授权(3项)及已受理国际PCT及国内发明专利共28项。



关于先进院


中国科学院深圳先进技术研究院(SIAT)是由中国科学院、深圳市人民政府及香港中文大学友好协商,在深圳市共同建立的,简称先进院。


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图13.先进院图标


20062月,中国科学院深圳先进技术研究院成立;2015年,获批全国博士后工作站。截至2016年底,研究院拥有员工1283人,拥有中国工程院院士3人。据20173月研究院官网显示,研究院拥有6个研究所和1个研发中心,外溢机构有5个、创新与育成中心有2个;拥有博士后科研流动站1个、一级学科博士点2个、一级学科硕士点2个、二级学科硕士点2个、全日制专业学位硕士点5个。2018322日,中国科学院深圳先进技术研究院正式获得国际AAALAC认证。



(已完结)




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